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      抗体的制备方法与原理
    作者:bioob  更新日期:2018-03-18 13:03    点击次数:


    一、抗血清的制备

      有了质量好的抗原,还必须选择适当的免疫途径,才能产生质量好(特异性强和效价高)的抗体。

      (一)用于免疫的动物

      作免疫用的动物有哺乳类和禽类,主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等,实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量,如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清,多用家兔和山羊,因动物反应良好,而且能够提供足够数量的血清,用于免疫的动物应适龄,健壮,无感染性疾患,最好为///雄性,此外还需十分注意动物的饲养,以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。若用兔,最好用纯种新西兰兔,一组三只,兔的体重以2~3kg为宜。

      (二)免疫途径

      免疫途径有多种多样,如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等,一般常用皮下或背部多点皮内注射,每点注射0.1ml左右。途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性,如激素、酶、毒素等生物学活性抗原,一般不宜采用静脉注射。

      (三)佐剂

      由于不同个体对同一抗原的反应性不同,而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱,因此常常在注射抗原的同时,加入能增强抗原的抗原性物质,以刺激机体产生较强的免疫反应,这种物质称为免疫佐剂。

      佐剂除了延长抗原在体内的存留时间,增加抗原刺激作用外,更主要的是,它能刺激网状内皮系统,使参与免疫反应的免疫活性细胞增多,促进T细胞与B细胞的相互作用,从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。

      常用的佐剂是福氏佐剂(Freund adjuvant),其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份,羊毛脂与石腊油的比例,视需要可调整为1:2~9(V/V),这是不完全福氏佐剂,在每毫升不完全佐剂加入1~20mg卡介苗就成为完全佐剂。

      配制方法:按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内,用超声波使之混匀,高压灭菌,置4℃下保存备用。免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合,用振荡器混匀成乳状,也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨,均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液(其中加卡介苗3~4mg/ml或不加),加完后再继续研磨成乳剂,滴于冰水上5~10min内完全不扩散为止。为避免损失抗原,亦可用一注射器装抗原液,另一注射器装佐剂,二者以聚乙烯塑料管连接,然后二者来回反复抽吸,约数十分钟后即能完全乳化。检查合格后即以其中一注射器作注射用。

      (四)免疫方法

      抗原剂量,首次剂量为300~500μg,加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。每2~3周加强免疫一次。加强免疫时用不完全佐剂,首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml,加强免疫时不必注射百日咳疫苗。

      在第2次加强免疫后2周,从耳缘静脉取2~3ml血,制备血清,检测抗体效价(见后)。如未达到预期效价,需再进行加强免疫,直到满意时为止(图2-3)。当抗体效价达到预期水平时,即可放血制备抗血清。

    图2-3 抗体反应

      (五)抗血清的采集与保存

      家兔是最常用以产生抗体的动物,因此这里主要讨论兔血的收集。羊等较大动物以颈静脉、动脉取血,鼠等小动物取血可参阅有关资料。取兔血有两种方法,一是耳缘静脉或耳动脉放血,一是颈动脉入血,也可心脏采血。取动脉或静脉放血时,将兔放入一个特造的木匣或笼内,耳露于箱(笼)外,也可由另一人捉住兔身。剪去耳缘的毛,用少许二甲苯涂抹耳廓,30s后,耳血管扩张、充血。用手轻拉耳尖,以单面剃须刀或尖的手术刀片,快速切开动脉或静脉,血液即流出,每次可收集30~40ml 。然后用棉球压迫止血,凝血后洗去二甲苯。二星期后,可在另一耳放血。此法可反复多次放血。颈动脉放血时,将兔仰卧,固定于兔台,剪去颈部的毛,切开皮肤,暴露颈动脉,插管,放血。放血过程中要严格按无菌要求进行。

      收集的血液置于室温下1h左右,凝固后,置4℃下,过夜(切勿冰冻)析出血清,离心,4000rpm,10min。在无菌条件,吸出血清,分装(0.05~0.2ml),贮于-40℃以下冰箱,或冻干后贮存于4。C冰箱保存。

      (六)抗血清质量的评价

      在免疫期间,不仅各个不同的动物,而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化,因而必须经常地采血测试。只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后,才可使用所取得的抗血清。

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